Rješavanje problema za elektroforezu gela

Sadržaj

smjerovi
savjeti
upozorenje
Što vam je potrebno

Elektroforeza s poliakrilamidnim gelom, ili PAGE, je tehnika koja se koristi za odvajanje organskih molekula u biološkom uzorku. Molekule manje veličine i težine brže migriraju u poliakrilamidni gel kada se primijeni električna struja. Oštre različite trake obično se opažaju nakon što se završeni gel inkubira na mjestu. To je relativno jednostavna metoda. Međutim, odsutnost traka, traka koje su mutne ili koje nisu jasne može ukazivati na problem u jednom ili više koraka metode. Trebate slijediti osnovne smjernice za rješavanje problema metode elektroforeze gela u kojima rezultati nisu očekivani.

smjerovi

Elektroforeza gela je uobičajena metoda za razdvajanje uzoraka proteina ili DNA (Jupiterimages / Comstock / Getty Images)

Počnite s posljednjim korakom elektroforeze gela i radite retroaktivno. Za elektroforezu u gelu, posljednji korak je postupak bojenja koji se koristi za promatranje traka uzorka. Tijekom procesa bojenja bi se trebao pojaviti mali broj problema. Međutim, boja za mrlje treba dobro otopiti u odgovarajućem puferu prije nego se koristi za bojenje gela. Provjerite je li korištena ispravna koncentracija boje.
Provjerite izvor napajanja. Odsutnost traka može značiti da je struja ili naponska konfiguracija previsoka, a ispitni uzorci migriraju iz gela. Visoke postavke također mogu uzrokovati prebrzu migraciju komponenti uzorka kroz gel, što rezultira lošom razlučivošću i nejasnim trakama. Uzorci ne smiju migrirati kroz gel ako je konfiguracija izvora energije niska. Uzorci se također mogu akumulirati u bunaru gdje su napunjeni i ne migrirati kroz gel.
Provjerite tekući akrilamid koji se koristi za pretvaranje poliakrilamidnog gela. Tipično, postotak akrilamida koji se koristi za pretvaranje poliakrilamidnog gela kreće se od 5% do 15%. Uzorci sastavljeni od većih molekula se stavljaju na 5% gel jer se veliki fragmenti u gelu kreću sporije s većim postotkom akrilamida. Male molekule se nanose na viši postotak gela, jer niska koncentracija gela ne može obraditi manje uzorke.
Provjerite reagense za polimerizaciju akrilamida. Poliakrilamidni gel nastaje polimerizacijom tekuće smjese koja se sastoji od bis-akrilamida i akrilamida. Amonijev persulfat i TEMED se dodaju akrilamidu za kataliziranje stvaranja gela. Tipično, akrilamid treba pokazivati znakove polimerizacije (formiranje gela) 15 minuta nakon dodavanja amonij persulfata i TEMED-a. Polimerizacija koja se odvija vrlo brzo rezultat je velikih količina amonijevog persulfata. Kada je nedovoljna, može uzrokovati nepotpunu ili neujednačenu polimerizaciju.
Potvrdite količinu učitanih uzoraka. Visoke koncentracije uzoraka mogu se polagano kretati kroz gel i smanjiti razlučivanje trake. Niska koncentracija uzorka ne može se promatrati nakon što je gel obojen. Ove boje predstavljaju ograničenja na minimalnu količinu uzorka koja se može vizualizirati kao rezultat osjetljivosti boje.
Potvrdite kvalitetu učitanih uzoraka. Soli i drugi kontaminanti prisutni u uzorku mogu utjecati na kretanje uzorka uz gel. Elektroforeza je rezultat prolaska električne struje kroz gel koji sadrži pufer provodne struje; visoke koncentracije soli u uzorku mogu utjecati na kretanje te struje kroz gel. Kada se izolira uzorak, treba uključiti komplet za pročišćavanje da se dobije relativno čist uzorak.
Pregledajte literaturu ili pisani protokol kako biste utvrdili je li korišten ispravan "PAGE" za izvođenje eksperimenta. Postotak akrilamida u "PAGE" je specifičan za veličinu uzorka koji se ispituje. U literaturi se također mogu dati specifične informacije o utvrđivanju izvora energije i brzini migracije uzorka.

savjeti

Smjernice su općenite za primjenu u biološkim istraživanjima.
Prilikom rješavanja bilo kojeg laboratorijskog postupka najbolje je započeti s posljednjim korakom i raditi retroaktivno kako bi se utvrdio problem.

upozorenje

Pri rukovanju akrilamidom i poliakrilamidom nosite rukavice. Akrilamid je neurotoksični reagens i može se apsorbirati kroz kožu. Poliakrilamid nije neurotoksičan, no često sadrži nepolimerizirani akrilamid i još se može smatrati toksičnim.