Sadržaj
Agarozni gelovi izrađeni su od strane znanstvenika koji rade u laboratorijima za molekularnu biologiju za proučavanje fragmenata DNA koji su modificirani tijekom eksperimentalnog rada. Tehnika izrade agaroznog gela temeljna je rutinska vještina koju svi istraživači moraju savladati jer omogućuje izravnu vizualizaciju različitih veličina DNA za projekte verifikacije i kloniranja gena. Iako priprema gela nije teška, kao i kod svih laboratorijskih postupaka, treba je suditi samo stručnjak koji je znanstveno obučen zbog bioloških rizika.
smjerovi
-
Pobrinite se da gel baze nemaju pukotine ili bilo što što bi moglo uzrokovati curenje vruće agaroze. Kašiku očistite 70% alkoholom i pustite da se potpuno osuši. Baza ima dva otvorena kraja i dva zatvorena kraja. U nekim formatima, isječci se isporučuju s njima kako bi se zatvorili krajevi, ali većina ih se mora zatvoriti postavljanjem traka između otvorenih dijelova. Čvrsto i čvrsto pritisnite traku, jer se mogu odmaknuti od držača i pustiti da vruća agaroza istječe.
-
Na temelju veličine fragmenta DNA koji se mora odvojiti i analizirati na agaroznom gelu, odrediti odgovarajući postotak koji će biti potreban. Na primjer, pri 1% (w / v), agarozni gel će biti učinkovit za analizu 0,5 do 10 kb DNA segmenta. Što je veći postotak (više agaroze), to su manji fragmenti koji se mogu odvojiti. Rutinski pokusi koriste raspon od 0,5% do 2% agaroze. Za 1% agarozni gel, izvagati 1 g agaroznog praha u kemijskom umaku ili drugom sustavu za zadržavanje. Pažljivo premjestite u laboratorijski prostor za pripremu gela.
-
U odgovarajućem području preparacije gela izmjerite 100 ml pufera za elektroforezu. Trebao bi biti na sobnoj temperaturi. Prenesite agarozni prah u vatrootpornu tikvicu i izlijte izmjerenu količinu pufera za elektroforezu. Lagano zagrijte smjesu u mikrovalnoj pećnici, ali je nemojte kuhati, jer isparavanje može promijeniti postotak prisutnog agaroze. Uvjerite se da je sva agaroza otopljena, dobro protresite i dobro promiješajte, ostavite da se malo ohladi i zatim dodajte 0,5 mikrograma po mililitru etidij bromida. Nemojte udisati pare jer to može nadražiti pluća i tkiva sluznice. Također, ne zagrijavajte otopinu nakon dodavanja etidij bromida. Ponovno protresite da se promiješa, a zatim dok je otopina još dovoljno vruća da se prolije, stavite je u pripremljenu bazu. Imajte na umu da ako je prisutan veliki volumen uzorka ili mala koncentracija DNA, može se načiniti deblji gel. Međutim, finiji gelovi se lakše analiziraju jer će biti jasnije fotografirani.
-
Umetnite češljeve u gel kako biste stvorili utore ili bunare za uzorak koji se stavlja. Pustite da se ohladi na sobnu temperaturu nekoliko sati ili u hladnjaku na nekoliko minuta. U potonjem slučaju, kada je gel spreman, treba promatrati prisutnost agaroznih kristala. Općenito, oni nestaju ako se gel ostavi da se zagrije na sobnu temperaturu na pultu nekoliko minuta prije upotrebe. Pažljivo uklonite češljeve kako se gel ne bi poderao ili razbili. Agarozni gel je sada spreman za upotrebu. Ako se ne koristi odmah, mora se omotati u celofan ili pohraniti u plastičnu posudu u hladnjaku kako bi se spriječilo isušivanje ili topljenje.
Priprema agaroznog gela
upozorenje
- Reagensi koji se koriste mogući su karcinogeni i njima treba postupati s pažnjom i odgovarajućom zaštitom. Ako se tijekom pripreme gela pojavi pogreška, ona se nikada ne smije ponovno zagrijavati, već se uklanja i ponovno pripravlja novi gel.
Što vam je potrebno
- Agarozni prah za elektroforezu
- TAE ili TBE pufer
- Otopina etidij bromida
- Baza za gel
- Trake za kasetu ili gel
- Češljevi za gelove
- Vage i potrošni materijal
- etanol
- Ručnici za laboratorij
- Osobna zaštitna oprema